Brève description:
L’amplification en chaîne par polymérase (polymerase chain reaction = PCR) permet de synthétiser des fragments d’ADN spécifiques d’une longueur atteignant 500 - 1000 Bp (amplification) à partir de quantités infimes d’ADN de départ. Les produits de PCR peuvent ensuite être détectés par ex. sur un gel d’agarose ou transformées par d’autres méthodes à d’autres fins. La Taq polymérase résistante à la chaleur, qui synthétise à partir d’un brin d’ADN le brin complémentaire, forme la base de la PCR. Le fait que la synthèse ne peut démarrer que sur des segments à double hélice d’ADN est mis à profit pour définir le fragment d’ADN à amplifier par le choix des oligonucléotides correspondants (primer = amorces), un par brin d’ADN. Le fragment d’ADN est répliqué de manière exponentielle, en parcourant 25-30 cycles à 3 niveaux de température. L’ADN est dénaturé à une température de 95°C, le double brin se séparant en deux brins simples. A une température de 55-68°C, les deux oligonucléotides (amorces) adhèrent spécifiquement au brin d’ADN isolé (annealing) et permettent le déclenchement de la réaction à Taq polymérase. Le brin complémentaire est synthétisé à une température de 72°C (extension).
La RT-PCR permet de mettre en évidence des séquences d’ARN spécifiques en transformant d’abord l’ARN en ADNc par la transcriptase inverse (RT) avant de procéder à une amplification par PCR classique.
La RT-PCR (PCR en temps réel) quantitative consiste à libérer lors de chaque cycle de synthèse du nucléotide marqué par un colorant fluorescent. Ceci permet de quantifier le fragment d’ADN en formation de manière fiable et précise, directement sur l’appareil à PCR.
Indication:
Les méthodes PCR trouvent de nombreuses applications dans le domaine des maladies hématologiques. Voici quelques exemples, à titre d’illustration: